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及培相对于红色色素
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简介真菌色素是天然色素的重要来源,具有独特的生产优势和生物活性,主要有红、黄、蓝三大色系。相对于红色色素,真菌黄色色素的种类较少,但在食品、化妆品等方面具有广阔的市场前景。目前已发现产黄色色素的真菌主要有 ...
真菌色素是真菌天然色素的重要来源,具有独特的色素生产优势和生物活性,主要有红、分离黄、表征蓝三大色系。及培相对于红色色素,养基优化真菌黄色色素的真菌种类较少,但在食品、色素化妆品等方面具有广阔的分离市场前景。目前已发现产黄色色素的表征真菌主要有(1)红曲霉属(Monascusspp)产生萘醌类红曲黄色素,并已商业化生产;(2)曲霉属(Aspergillus)A.cristatus和A.xavus产生羟基蒽醌类黄色素;(3)青霉属Penicilliumcitreonigrum产生黄色素;(4)散囊菌属Eurotiumrubrum分泌蒽醌类棕黄色色素。及培而Simplicillium属真菌产生的养基优化色素则未见报道。
本实验室从蓝藻培养液中分离出一株共生真菌Simpliciiliumlanosoniveum(DT06)。真菌该真菌在沙氏培养基中合成一种新的色素抗生素、胞外多糖和微量的分离色素,而在含碳无机培养基中则大量合成黄色素(DT06色素),这也是首次发现Simplicillium属的真菌能够合成色素。本文对DT06色素进行分离纯化、表征,研究其抗氧化性和稳定性,并采用Plackett—Burman和响应面设计,对其发酵培养基成分进行优化,为该色素的进一步应用奠定基础。
一、材料与方法
1、材料
(1)菌种与培养基
真菌DT06(Simplicilliumlanosoniveum)由河北工业大学代谢工程实验室分离,现保藏在中国科学院微生物研究所菌物标本馆,保藏编号HMAS242045。PDA培养基(1L):马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15g,pH自然。
改良BG-11培养基(1L):NaNO30.76g,K2HP040.48g,MgS04·7H20O.075g,CaCl2·2H200.036g,葡萄糖18g,Criticacidstock(CS)10mL,Tracemetalmix(TM)lmL,pH自然。
(2)材料、仪器与设备
2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH):南京奥多福尼生物科技有限公司;其他分析纯化学品均购自天津大学科威公司。
Agilent-1200高效液相色谱仪:美国Agilent公司;CARy300型紫外光谱分析仪:上海精科仪器厂;RE-5205旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂。
2、方法
(1)发酵方法
将4℃保藏的真菌DT06接种于PDA斜面培养基上,25℃培养5d,无菌条件下配制成孢子悬浮液,接种于100/250mLBG-11培养基中,在25℃、130r/min条件下摇床培养36h制成种子液,以l%的接种量把种子液转接到80/250mL改良BG-11培养基中,在相同条件下摇床培养7d。
(2)色素的分离与纯化
将发酵液在8000r/min条件下离心10min,除去菌丝体,收集上清液。500mL上清液中加入300mL盐酸酸化的乙酸乙酯,充分震荡,静置取上层乙酸乙酯萃取液。滤液低压蒸馏除去乙酸乙酯,得到的色素用甲醇溶解,再用0.22μm滤膜过滤,得到高纯度甲醇色素溶液。
(3)色素的色谱分析及含量计算方法
将得到的高纯度色素溶液用适量甲醇稀释,用紫外-可见分光光度计进行全波段扫描(200~800nm),以确定最大吸收波长。
采用Agilent-1200高效液相色谱仪进行分析,色谱条件:C18(Kromasil)色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);进样量:20μL;柱温:25℃,紫外-可见光检测器。在上述条件下检测DT06色素的最佳流动相及流速。
在色素的最大吸收波长下,用吸光度值表示色素含量,色素含量表示为最大吸收波长下每毫升澄清发酵液的吸光度值。
(4)色素的抗氧化活性
分别测定真菌DT06色素对DPPH自由基、ABTS自由基、超氧自由基和羟基自由基的清除能力。DPPH自由基、ABTS自由基和超氧自由基的清除率计算公式为:[1-(A1-A2)/A0]×100;羟基自由基清除率计算公式为:(A1-A0)/(A2-A0)×100,其中A1、A2和A0分别为实验组、对照组和空白组的吸光值。相同条件下,用等浓度的维生素C做阳性对照。
(5)色素的稳定性
分别取一定量的色素溶液于具塞试管中,研究不同温度(4、20、40、60、80、100℃)、光照(黑暗、光照、紫外、12000LX)、pH(2、4、6、8、10)对其稳定性的影响,每24h取样一次,用280nm处的吸光度值表示色素含量。
(6)培养基各组分的优化
在BG-11培养基的基础上,利用Plackett-Burman(PB)试验设计,研究葡萄糖(X1)、NaN03(X2)、K2HP04(X3)、MgS04·7H20(X4)、CaCl2‘2H20(X5)、CS(X6)、TM(X7)对真菌DT06生产色素(Y)的影响,在PB实验设计结果的基础上,用Box-Behnken设计(BBD)进行响应面优化。
二、结果与讨论
1、色素的色谱分析
酸化的乙酸乙酯萃取液经减压蒸馏、甲醇复溶得到高纯度色素溶液,呈浅黄色(图1)。DT06色素能溶于水,不同于A.cristatus产的黄色素。色素甲醇溶液的紫外可见扫描光谱如图2a所示,在285nm处有特征吸收峰,与P.citreonigrum和E.rubrum黄色素分别在330nm和396nm处的特征吸收峰不同,285nm可以作为检测波长用于高效液相色谱分析和色素含量测定。
根据色素的极性和色谱柱的性质来选择合适的流动相和流速,最终确定当流动相为乙腈:水(2:8,V/V)、流速为0.8mL/min时色谱柱对色素的分离效果最好,如图2b所示,在10.52min左右出现单一峰(7.84min为甲醇溶剂峰),峰形陡峭、对称性良好,表明色素纯度较高。
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相关链接:苯并噻唑,二铵盐,三硝基苯肼,培养基
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